LITOS: 光遺伝学的刺激のための多用途 LED 照明ツール

Dec 22, 2023

Scientific Reports volume 12、記事番号: 13139 (2022) この記事を引用

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メトリクスの詳細

光遺伝学は、高い時空間分解能で生物学的プロセスを操作するための重要なツールとなっています。最近、光遺伝学実験におけるスループットを提供するために、多くの商用およびオープンソースのマルチウェル照明デバイスが開発されています。ただし、市販のデバイスは依然として高価で柔軟性に欠けていますが、オープンソースソリューションにはプログラミングの知識が必要であったり、複雑な組み立てプロセスが含まれたりすることがあります。市販の 32 × 64 LED マトリックスを照明源として制御する、組み立てられたプリント基板に基づく光遺伝学的刺激用 LED 照明ツール (LITOS) を紹介します。 LITOS ははんだ付けをせずにすぐに組み立てることができ、デバイス自体でホストされている Web サイトからアクセスできる使いやすいインターフェイスを備えています。コーディングの専門知識がなくても、複雑な光刺激パターンを簡単にプログラムできます。 LITOS は、さまざまな形式のマルチウェルプレート、ペトリ皿、フラスコで使用できます。我々は、FGFR1およびRaf光遺伝学的アクチュエーターを使用して、さまざまな動的光刺激レジームに応答するMAPK / ERKシグナル伝達経路の活性を測定することにより、LITOSを検証しました。 LITOS はウェル内のすべての細胞を均一に刺激することができ、柔軟な時間的刺激スキームを可能にします。 LITOS の手頃な価格と使いやすさは、あらゆる研究室で光遺伝学を民主化することを目的としています。

光遺伝学は神経生物学で最初に使用されました 1 が、現在では高い時空間分解能でさまざまな細胞生物学的プロセスを制御するために広く使用されています 2。これは、ほぼすべての細胞生物学的プロセスを制御するアクチュエーターを構築するために設計された多数の光応答性タンパク質ドメインの発見によって可能になりました 2。細胞システムを混乱させる光遺伝学の正確さは、細胞システムの動的な制御のより深い理解につながる可能性があります3。ただし、光遺伝学的実験には、適切な光刺激ハードウェアも必要です。

古典的な光遺伝学的実験セットアップでは、自動光学顕微鏡を使用して、光遺伝学的アクチュエーターを発現する細胞を刺激し、所望の細胞出力を記録します。蛍光顕微鏡でスペクトル互換性のあるバイオセンサーと組み合わせると、このセットアップは、光遺伝学的アクチュエーターを使用して細胞入力を制御し、バイオセンサーを使用して出力ダイナミクスを記録することができます4。これは、シグナル伝達ダイナミクスを研究するための非常に強力なアプローチであることが証明されています5、6、7。残念ながら、顕微鏡のレンズシステムの視野により、光刺激を受ける細胞の数が制限されます。したがって、顕微鏡では、生化学的方法を使用して細胞出力を測定するのに十分な細胞を刺激することができません。さらに、並行して誘発できる異なる入力刺激パターンの数は制限されています。最後に、特に顕微鏡施設では、数日の時間スケールでの細胞の長期光遺伝学的制御は非現実的であるか、費用がかかりすぎる可能性があります。

専用の照明源を使用して刺激をイメージングプロセスから分離すると、これらの制限の一部が回避されます。インキュベーターに取り付けられた LED ストライプを使用して、多数の細胞の光遺伝学アクチュエーターを刺激することができ、ウェスタンブロット、プロテオミクス、トランスクリプトミクスなどの生化学的手法を使用して細胞の出力を測定する可能性が開かれます8。

より高度なセットアップでは、マイクロコントローラーと光源を組み合わせて、マルチウェルプレートの個々のウェルを特別に照明します。これにより、異なるパターンの光入力で複数のウェルを並行して刺激できるようになり、実験のスループットが向上します。 LED を照明源として利用する多くのハードウェアソリューションが開発されています9、10、11、12。これらのオープンソースデバイスはかなり安価ですが、プログラミングの知識が必要であり、ほとんどの研究室では利用できない製造の専門知識に依存している可能性があります。最近、いくつかの市販製品 (AXION Biosystems の LUMOS など) が市場に参入しましたが、コストは依然として高いです。実験の柔軟性を提供する、安価で組み立てが簡単でユーザーフレンドリーなデバイスは、光遺伝学のコミュニティではまだ存在していません。

ここでは、あらゆる細胞生物学研究室で光遺伝学を民主化するための新しい光遺伝学刺激用 LED 照明ツール (LITOS) を紹介します。 LITOS を使用すると、さまざまなマルチウェルプレート形式、ペトリ皿、または細胞培養フラスコで大規模な細胞集団に対するハイスループットの動的光刺激が可能になります。その使いやすさにより、技術的な知識がほとんどなく、コーディングスキルのないユーザーでも簡単にデバイスを使用し、複雑な照明パターンを設定できます。また、LITOS は最小限の工具で簡単に組み立てることができます。 LITOS アセンブリの詳細な説明を提供し、複雑な照明パターンを構成するためのユーザーフレンドリーな GUI ソリューションを文書化します。我々は、FGFR1およびRafに基づく光遺伝学的アクチュエーターを発現する哺乳動物細胞株を使用し、生化学的アプローチとイメージングアプローチの両方を使用して、シグナル伝達出力としてマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）/細胞外シグナル調節キナーゼ（ERK）経路を評価して、LITOSを検証しました。

複雑な製造手順の必要性を最小限に抑えるために、LITOS は完全に市販のコンポーネントに基づいています (図 1、2a)。 LITOS はカスタムプリント基板 (PCB) を利用しており、PCB メーカーに事前に組み立てられた状態で注文できます。 PCB は、市販の RGB LED マトリックスの制御ユニットとして機能します。 PCB には ESP32 マイクロコントローラーが搭載されており、LED マトリックスとワイヤレスネットワークノードを制御するのに十分な計算能力を提供します (図 2b)。 RGB LED マトリックスは、3 mm ピッチの 32 × 64 LED のアレイで構成され、赤、緑、青の光を任意に組み合わせて照明できます。 6、12、24、48、または96個のマルチウェルプレート、さらにペトリ皿や細胞培養フラスコで培養された細胞を照明できます（図2c）。この 3 mm ピッチ LED マトリックス形式を選択したのは、一般的な 96 ウェルプレート (9 mm) レイアウトと完全に一致し、各ウェルの中心に 2 × 2 LED アレイが配置されるためです。さらに、RGB LED マトリックスにより、ユーザーは 3 色の強度を自由に調整できます。個々の LED はそれぞれ、LED からサンプルが離れるにつれて増加する領域を照らす光の円錐を生成します。したがって、サンプルとLEDの間の距離を増やすことにより、照明野は徐々に均一になります（補足図S1a、b）。この研究で使用した 96 個のマルチウェルプレートの場合のように、サンプルが LED から 2 mm の距離に配置された場合、サンプルは均一な照明にさらされ、最大光強度の変動は 25% であることがわかります。井戸の端。この距離を長くすると、照明の均一性がさらに向上しますが、96マルチウェルプレートの隣接するウェルを部分的に照明するというコストがかかります（補足図S1a、b）。これはオプションのままですが、LITOS では、同様の装置で使用されているような、井戸内の照明の均一性を向上させるための光拡散器を必要としません9。さらに、LITOSのLEDマトリックスを使用すると、96個のマルチウェルプレートのウェル内の個々のLEDを制御して、一部の実験で有利になる可能性のある不均一な光照明パターンを構築できます（補足図S1c）。個々の LED の強度を変調することにより、LITOS は cm スケールにわたる光の勾配を生成できます (補足図 S1d)。

LITOS コンポーネントの回路図。 LITOS は、制御ユニットとして機能するプリント基板 (PCB) と市販の 32 × 64 RGB LED マトリクスの 2 つの部分で構成されています。 LITOSは、WLAN接続を介してパソコンやスマートフォンから制御できます。 PCB は 32 × 64 RGB LED マトリックスを制御して光遺伝細胞を照明します。高密度に配置された LED マトリックスにより、さまざまな細胞培養ディッシュやウェルプレートの照明が可能になります。画面と 4 つのボタンを備えた LITOS は直接制御でき、実験の実行やユーザーの介入が必要なアクションに関するメッセージを表示できます。

LITOS は柔軟な光刺激パターンを生成できます。 (a) 組み立てると、LITOS は PCB と 32 × 64 LED マトリックスで構成されます。ここでは、LITOS を使用してウェルごとに 4 つの LED の 8 × 12 マトリックスを生成し、96 ウェルプレートの各ウェルを刺激します。 (b) PCB は、マトリックスの操作に必要なすべてを提供します。WLAN モジュールを備えたマイクロコントローラー、LED マトリックスへの接続、ディスプレイ、およびユーザー定義のアクション用の 4 つのボタン (プレートの輪郭のマーキング、実験の開始と実験の終了など)。。 (c) さまざまなプレートまたはディッシュ形式を使用した LITOS アプリケーションの例。左のパネル: プレートの位置合わせにオプションのプレキシガラスマスクを使用した、2 つの 96 ウェルプレートの同時刺激。右上: 2 つの 100 mm ペトリ皿。左下: 単一の 96 ウェルプレートの交互照明パターン。右下: 6 ウェルプレートの刺激パターン。

PCB モジュールと RGB LED マトリクスはフラットリボンケーブルと電源ケーブルで接続されています。はんだ付けを必要としない簡単な組み立て手順です。 LITOS とオプションの 3D プリントケース (補足図 S2) の回路図は、GitHub ページ (https://github.com/pertzlab/LITOS) にあります。

暗い環境でプレートの位置合わせを容易にするために、3 つのソリューションを実装しました。(i) LITOS を使用して、LED マトリックス上に目的のウェルプレートの参照輪郭を表示します。これは、PCB 上のボタンで直接アクティブ化できます (補足図 S3a)。 ); （ii）プレートをLEDマトリックスの左上隅に位置合わせする（補足図S3b）、および（iii）LEDマトリックス上にプレートを配置するマスクを使用する（後者は3D印刷またはCNCフライス加工で製造できます）（補足図S3c)。このようなマスクを使用すると、1 つの LITOS デバイス上に 2 つのマルチウェルプレートを同時に配置して刺激することもできます。

PCB メーカーが組み立てたカスタム PCB と既製の LED マトリクスで構成される LITOS の総コストは、約 200.00 米ドルになります。この低価格のデバイスにより、ユニットを追加注文することで実験を簡単にスケールアップできます。複数台ご注文の場合はさらに単価を下げることが可能です。

ハードウェアと同様に、LITOS のソフトウェアも使いやすいように設計されています。制御ユニットにあるソフトウェアはユーザー定義の照明スキームを使用し、それが処理されて LED マトリックスを制御します (図 3a ～ c)。

LITOS一般ユーザーのワークフロー。 (a) 特定の照明パターンを生成するための実験ワークフローの概略図。希望のパターンを含む csv ファイルは、Web ブラウザーを介して、コントロールユニットがホストする「構成インターフェイス」にアップロードできます。次に、制御ユニットは、アップロードされた照明パターンに従って LED マトリックスを動作させます。 (b) 特定の照明パターンに使用される csv ファイルの例。ここでは、ウェル A01 と B01 が 5 分ごとに 3 秒の青色光パルスで照射されるようにプログラムされています。ウェル C01 と D01 は同じパターンでプログラムされていますが、遅延は 30 分です。どちらの場合も、実験の合計時間は 1 時間です。 (c) LITOS がホストするユーザーインターフェイスを使用して照明パターンを転送し、その後光遺伝学実験用に読み込むことができます。

希望の照明パターンを設定するためにプログラミングの知識は必要ありません。どの LED を、どの特定の時間に、どの特定の期間、どの特定の色でオンにするかを定義するには、ユーザーはカンマ区切り値 (csv) ファイルを作成します。これは、Google Sheets、Microsoft Excel、LibreOffice Calc などのスプレッドシートアプリケーションを使用して実行できます。 csv ファイルでは、各行に照明コマンドが記述されています (図 3b)。各列は、刺激プログラムのさまざまなパラメータを示します。つまり、アクティブにする LED、照明の開始時間、照明期間、アクティブな LED の色と強度です。マイクロコントローラーの限られたリソースの一部を他のソフトウェアプロセスに解放するために、最小パルス期間を 1 秒に制限しました。他のカラムでは、刺激パターンを複数回繰り返すループの生成が可能です (たとえば、10 分ごとに 3 時間照射)。ユーザーが常に個々の LED を定義する必要がないように、事前定義された領域を照らすキーワードを設計しました。 (i) 井戸 (例: 井戸 A02 の場合は「A02」/「A2」)。 (ii) 列と行 (たとえば、行 D 全体を表す「D」)。 (iii) マルチウェルプレート (プレート) 全体。 (iv) マトリックス全体 (Whole)。 (v) 円と四角形 (Rec_start_end)。 LITOS のソフトウェアは、これらのキーワードをマトリックスの対応する LED 位置に変換します。さらに柔軟性を高めるために、個々の LED を制御することも可能で、たとえば、強度や色の勾配を生成したり、テキストを表示したりすることができます。

さらに、このような CSV ファイル内で、カウントダウン付きのカスタムメッセージをコントロールユニットに表示するようにプログラムできます。これは、例えば試薬を特定のウェルにピペッティングするなど、光遺伝学的実験中にユーザーが追加のタスクを実行するのに役立ちます。これらのタスクは時間に左右される可能性があるため、小型の圧電ブザーは、視覚信号に加えて追加の聴覚信号でユーザーをサポートします。

照明パターンの csv ファイルは、Wi-Fi モジュールを介してコントロールユニットに転送されます。 JavaScript ベースの構成インターフェイス (図 3c) は、照明パターンのアップロードと管理、設定の変更、実験用の LITOS の準備を行うために制御ユニット上でホストされています。複数の照明パターンを制御ユニットの内部メモリに保存できるため、刺激パターンを再アップロードすることなく再利用できます。コントロールユニットの設定インターフェイスには、LITOS によって作成された WLAN アクセスポイントまたはローカル Wi-Fi ネットワーク経由でアクセスできます。 LITOSのIPアドレスや作成したWLANアクセスポイント名など、接続に必要な情報が内部ディスプレイに表示されます。接続すると、ユーザーはプラットフォームに関係なく、任意のコンピュータまたはスマートフォンの Web ブラウザから設定インターフェイスにアクセスできます。

照明パターンを転送して選択すると、LITOS は実験を実行する準備が整います。 LITOS ボタンを使用すると、ユーザーはメニューの移動、実験の開始または中止、またはマルチウェルプレートを配置する場所を RGB マトリックス上の輪郭で示すことができます。 LITOS 上の照明プログラムの現在の進行状況は、コントロールユニットのディスプレイで直接監視できます。補足ムービー S1 は、96 ウェルプレートの各列が順番に照明される刺激パターンを適用する LED マトリックスを示しています。

初期実験を行っているときに、LED マトリックスが熱を発生し、細胞の健康に悪影響を与える可能性があることがわかりました。 LED マトリックスは、光刺激が発生していないアイドル状態でも発熱することがわかりました。この問題を解決するために、N および P 金属酸化物半導体電界効果トランジスタ (MOSFET) を使用した回路を LITOS の制御ユニットに統合し、照明プロセスが必要な場合にのみマトリックスに電流を供給しました。これにより、反復的な刺激パターンで観察される熱の発生が減少しました。次に、さまざまな刺激パターン後の培地温度を測定することで、LITOS 照明による培地温度の変化を評価しました。予想通り、私たちの測定結果は、より長くより頻繁な光刺激がより高い温度上昇をもたらし、約1時間後にプラトーに達したことを示しています（補足図S4）。ただし、この記事で示した実験では、細胞の健康を損なうほどの熱を発生させる光刺激スキームはまったく必要ありませんでした。実験で非常に長時間持続する光入力が必要な場合は、小型のパッシブヒートシンクを追加すると過熱を軽減できる可能性があります。別のアプローチは、持続的な光依存性相互作用を引き起こすために、低い koff で光遺伝学モジュールを設計することです。たとえば、iLID (改良型光誘導二量体) システムでは、光依存性相互作用の親和性と寿命は、さまざまな突然変異によって操作できます 13。

LITOS は、幅広い光遺伝学アプリケーションやモデルシステムに適しています。 LITOS の柔軟性と多用途性を実証するために、MAPK/ERK 経路を研究する光遺伝学実験を実施しました。 MAPK ネットワークは、さまざまな細胞外および細胞内の合図を解読して、それらを特定の運命決定に変換することができ、生理学と病理学の両方で極めて重要な役割を果たしています 14。このため、この経路のさまざまなシグナル伝達ノードを制御および測定するための複数の光遺伝学的アクチュエーターと蛍光バイオセンサーが開発されており、LITOSを紹介する理想的なモデルシステムとなっています。

我々はマウスNIH3T3線維芽細胞とMCF10A乳上皮細胞株を使用し、MAPKネットワーク内のさまざまなノードを活性化する光遺伝学的アクチュエーターとERKシグナル伝達出力の動態を記録する蛍光バイオセンサーからなる遺伝的にコードされた回路を安定して発現するように操作した。この回路は、光遺伝学的線維芽細胞増殖因子受容体（optoFGFR）で構成されており、線維芽細胞増殖因子受容体 1 のミリストイル化細胞内ドメインと光感受性ドメイン CRY2 が融合したもので構成されており、青色光による刺激により多量体化、自己リン酸化し、MAPK 経路を活性化します 4 。 ERK シグナル伝達出力は、単一細胞分解能で ERK 活性を報告する ERK キナーゼ転座レポーター (KTR) を使用して測定できます 15。光遺伝学的活性化とスペクトル的に適合するために、ERK-KTR は、optoFGFR を活性化せずに励起できる mRuby2 赤色蛍光タンパク質と融合されています。さらに、両方の細胞株は、遠赤色蛍光タンパク質 miRFP703 に融合されたヒストン H2B 核マーカー (H2B-miRFP703) を安定して発現します。この遺伝回路のスキームを図4aに示します。次に、コンピュータービジョンアプローチを使用して、各細胞のERK活性化状態を推測しました（図4b）。この目的のために、H2B-miRFP703 チャネルを使用して核を自動的にセグメント化し、核マスクと核周囲のサイトゾルリングマスクを導出するために使用しました。次に、細胞質マスクと核マスクを使用した ERK-KTR-mRuby2 チャネルの蛍光強度の中央値の比が、ERK 活性の代用値 (C/N 比) として計算されます 16。

MAPK 経路シグナル伝達ダイナミクスの研究における LITOS。 (a) optoFGFR が刺激されると、MAPK 経路が活性化され、リン酸化とその後の ERK の活性化が引き起こされます。活性型 ERK は ERK-KTR をリン酸化し、サイトゾルへの可逆的な移行を引き起こします。 (b) 画像分析用のコンピュータービジョンパイプライン。核マーカー H2B に基づく NIH3T3 細胞の核分割 (赤) とそのリング状の拡大 (青) を使用して、ERK-KTR のサイトゾルと核の比率 (C/N) を測定します。高い C/N 比は、高い ERK 活性に対応します。 (c) 上の行は、直径 6.38 mm のウェル (96 ウェルプレート) 内のすべての NIH3T3 細胞の色分けされた ERK-KTR C/N 比を表します。下の 2 つの行は、上の大きな画像を構成する FOV のフル解像度の例を表しており、H2B-miRFP703 と ERK-KTR-mRuby2 が反転グレースケールで示されています。（ d ）ERK-KTRを発現するMCF10A細胞を10秒間の光パルスで刺激し、4％パラホルムアルデヒドで固定し、（b）に示すようにERK活性を定量しました。次に、ERK 活性を、同じ細胞からのリン酸化 ERK および総 ERK に対するウェスタンブロットと比較しました (下記)。ネイティブでトリミングされていないウェスタンブロットは、補足図S4で利用できます。

私たちが評価した LITOS の最初の特徴は、1 つのウェル内のすべての細胞を均一に刺激する LED アレイの能力でした。この機能は、全人口アプリケーションにとって非常に重要です。この目的のために、各ウェルが 4 つの LED で照明される 96 ウェルプレートを刺激し、各ウェル全体の大きなモザイク画像を取得することによってウェルのすべての細胞の ERK-KTR C/N を測定しました。ウェル全体の各単一細胞のERK-KTR C/N比値を表示すると、単一ウェルの4つのLEDがMAPK経路の強力かつ均一な光遺伝学的活性化を誘導したことが明らかになりました（図4c）。異なる実験が隣接するウェルで行われたため、これはまた、こぼれ出る少量の光がERK活性の活性化につながらないことを示している。

次に、ホスホERK抗体（pERK）を用いたウェスタンブロット分析を使用して、集団平均生化学的方法で強力なERK活性化を生成するLITOSの能力をテストしました。十分なタンパク質溶解物を生成するために、MCF10A 細胞を 6 ウェルプレートに播種し、ウェルあたり約 250 μg のタンパク質溶解物を生成しました。 6 ウェルプレートのウェル全体を照明するには、112 個の LED をオンにする必要がありました (図 2c、右下のパネル)。 LITOS を使用して青色光の 10 秒パルスを使用して optoFGFR 発現細胞を刺激し、3 分間隔の異なる時点でパラホルムアルデヒドを使用して細胞を固定しました。ウエスタンブロットとERK-KTRバイオセンサーを使用して観察されたERK活性化ダイナミクスを比較するために、タンパク質抽出前にすべてのウェルでERK-KTR C/N比を測定しました。単一細胞 ERK-KTR C/N 比の局所的な変動を平均するために、16 FOV で各ウェルをサンプリングし、それらの母集団平均を計算しました。内因性 pERK のウェスタンブロット測定は、ERK-KTR バイオセンサーを使用した ERK キナーゼ活性の測定に厳密に続きます。以前の観察と一致して 5,16、pERK シグナルと ERK-KTR シグナルは両方とも、光刺激直後に ERK 活性の急激な増加を示し、その後適応が遅くなり、適切な 20 分で刺激前の ERK 活性レベルに達しました。 ERK-KTRシグナル（6分でピーク）は、pERKシグナル（3分でピーク）と比較してわずかに遅延しました（図4d）。これは、ERK が核に移動するのに必要な時間、および/または ERK-KTR バイオセンサーがサイトゾルに移動するのに必要な時間を反映している可能性があります。

これらの実験は、LITOS が大きなウェル内のすべての細胞を均一かつ確実に活性化できることを示し、ウェスタンブロットに必要な多数の細胞を刺激できることを示しています。これにより、LITOS は他の集団平均測定 (トランスクリプトミクスや (リン) プロテオミクスなど) とも互換性があります。

動的な生物学的プロセスの制御において光遺伝学の可能性を最大限に活用するには、LITOS は、複雑な照明パターンを作成する際に高い柔軟性を備えているだけでなく、さまざまな光遺伝学アクチュエーターを活性化できる必要があります。したがって、LITOS がこれらの要件を満たしていることを実証するために、一連の追加実験を実行しました。以下のすべての実験では、実験終了時に 96 ウェルプレート内の細胞を同時に固定できるように、特定の時間に自動的に異なるウェルに光入力を適用するように LITOS をプログラムしました。細胞固定後、自動顕微鏡を使用してプレートのすべてのウェルを画像化しました。次に、自動画像解析パイプラインを利用して、ウェルごとの平均 ERK 活性を計算しました。時間分解方式で MAPK ネットワークを活性化するために成長因子をピペッティングしてこのような実験を行うのは、非常に手間がかかることに注意してください。

まず、LITOS が、optoFGFR とは異なる活性化メカニズムを使用する光遺伝学的アクチュエーターを刺激できるかどうかを評価しました。光感受性膜受容体の多量体化に基づくoptoFGFRとは対照的に、optoRaf17は、CRY2システムを介した膜への触媒性c-Rafドメインの光依存性動員を伴う。 LITOS が optoRaf を刺激できるかどうかを評価するために、異なる持続時間の光入力をスクリーニングし、それらを optoFGFR 刺激と比較しました。我々は、30秒の光パルスがoptoRafシステムとoptoFGFRシステムでより高いERK振幅を誘導することを観察しました（図5a）。これは後の時点でも明らかでした。以前に観察されたように、光入力の増加に応答して、optoFGFR は過渡的な ERK ダイナミクスから持続的な ERK ダイナミクスへの移行を引き起こしました5。一方、optoRaf は常に適応的な ERK ダイナミクスを示しました。 optoFGFR と optoRaf 入力によって誘発される異なる ERK ダイナミクスは、異なる作動メカニズム、または MAPK ネットワーク内の異なるレベルから ERK を活性化する 2 つのアクチュエーターの能力の違いを反映している可能性があります。optoFGFR は、下流の完全な MAPK ネットワークの活性化をトリガーします。一方、optoRaf は孤立した MEK/ERK ネットワークの活性化のみを引き起こします。これは、LITOS を使用して、さまざまな光遺伝学的アクチュエーターによって誘発される ERK ダイナミクスを研究する方法を示しています。

MAPK シグナル伝達ダイナミクスの研究における LITOS の多用途性を紹介します。（a）さまざまな時点でのoptoFGFRまたはoptoRaf光入力に対するERK応答。（ b ）異なる濃度のRaf阻害剤RAF709、ERK阻害剤SCH772984、およびMEK阻害剤U0126を使用して、単一の96ウェルプレートで実行された、optoFGFRを発現するNIH3T3の小規模薬物スクリーニング。 (c) 1 分の時間分解能で測定された LITOS による 2 秒間の単一青色光パルス後に測定された ERK 活性ダイナミクス。 (d) LITOS で生成された拍動性および持続性の ERK 活動ダイナミクスの比較。（a〜d）ERK活性はERK-KTR C / Nとして測定されました。箱ひげ図は、単一細胞 ERK-KTR C/N 測定値の中央値 (中心線)、第 2 および第 3 四分位数 (箱)、および 1.5 四分位範囲 (ひげ) を表します。折れ線プロットは、単一セル ERK-KTR C/N 測定の平均 (線) と平均間隔の標準誤差 (誤差バー) を表します。

次に、ERK動態を読み出しとして薬物スクリーニングを実行するLITOSの可能性をさらに評価しました（図5b）。概念の実証として、MAPK 経路を阻害する 3 つの薬剤、Raf 阻害剤 RAF709、MEK 阻害剤 U0126、ERK 阻害剤 SCH772984 をテストしました。各阻害剤を 2 つの濃度で適用しました。我々は、阻害剤の存在下で単一の10秒青色光パルスでoptoFGFR細胞を刺激し、2分の時間分解能で12の異なる時点でERK活性を測定した。 3 つの薬剤はすべて、用量依存的に ERK 活性を低下させました。 ERK活性のピークは、RAF709およびU0126の2つの最高濃度で顕著に減少し、最高濃度のSCH772984ではさらに消失しました（図5b）。これは、LITOS が比較的少ない労力で信号伝達ダイナミクスの摂動をスクリーニングするのに適していることを示しています。

次に、高い時間分解能を必要とする ERK ダイナミクスを研究するための LITOS の可能性を評価しました。この目的のために、我々は、青色光の単一の2秒パルスでoptoFGFR細胞を刺激し、1分の時間分解能で細胞を固定した。これにより、ERK活性化の急峻な段階とそれに続く適応のより遅い段階など、ERK活性化の動態の詳細が高度に分解能で捕らえられました（図5c）。この結果は、LITOS が急速なシグナル伝達イベントを研究できる能力を強調しています。

私たちがこれまでに記録した実験は、単一の青色光パルスに基づいています。しかし、異なる信号伝達ネットワークは、一時的、持続的、振動的、または拍動的な信号伝達ダイナミクスで構成され得る、異なる動的信号伝達パターンをエンコードすることが知られている18。合成生物学のアプローチを使用してこれらの複雑な動態プロファイルを再現すると、これらの動態を形成するネットワークについて重要な洞察が得られる可能性があります。したがって、特定の合成 ERK ダイナミクスパターンを呼び出す、より複雑な光入力パターンを生成する LITOS の機能を評価しました。そのために、高周波数（2分ごと）または低周波数（20分ごと）の10秒長の光パルスで合計84分間、optoFGFR細胞を刺激するようにLITOSをプログラムしました。高周波光パルスが持続的なERKダイナミクスを引き起こすことがわかりました（図5d）。これは、単一の青色光パルスによって optoFGFR が約 5 ～ 10 分間オンになるという発見と一致しており、したがって、optoFGFR が 2 分ごとに再活性化されても ERK は不活性化されません。対照的に、低周波光パルスは連続した離散的な ERK パルスを誘発し、新しい光入力が適用されるまですべてベースラインへの適応を示しました。これは、LITOS を使用してユーザー定義の合成 ERK ダイナミクスを正確に調整する方法を示しています。この実験では、ウェルプレートの86個のウェルに異なる光刺激スキームを適用する必要があり（補足図S6およびS7の刺激スキーム）、LITOSが取り組むことができる実験の複雑さを示しています。 LITOSは、我々が以前にoptoFGFR-カルシニューリン活性化に起因することを示したERK-KTRリン酸化の一時的な減少を捕捉するための時間分解能を提供しました5。まとめると、これらの結果は、LITOS が非常に柔軟な光遺伝学デバイスであり、MAPK 経路の動態を研究するための複雑な実験を実行できることを示しています。

我々は、インキュベーターベースの光遺伝学的刺激実験の民主化を目的とした、ユーザーフレンドリーで安価、組み立てが容易で堅牢な LED マトリックスツールである LITOS を紹介します。 LITOSは、オンラインで簡単に購入またはメーカーから注文できる部品で構成されています。ここと GitHub リポジトリ (https://github.com/pertzlab/LITOS) で、LITOS をアセンブルして使用する手順を提供します。また、LITOS を制御するための専用ソフトウェアソリューションについても文書化しています。私たちは、さまざまな光遺伝学的アクチュエーターによって操作でき、蛍光バイオセンサーを使用して測定できる動的なMAPKシグナル伝達経路を研究することによってLITOSのベンチマークを行います。これは、LITOSのLED密度がウェルプレートで培養されたすべての細胞を均一に刺激するのに十分であることを実証し（図4c）、ウェスタンブロットなどの生化学的方法を使用して信頼性の高い集団平均測定を実行できるようにします（図4d）。さらに、LITOS が 2 つの異なる光遺伝学的アクチュエーターと互換性があり (図 5a)、小規模な薬物スクリーニングを実行するために必要なスループットを提供し (図 5b)、高い時間分解能の測定が可能であり (図 5c)、複雑な光刺激スキーム（図5d）。これらの機能は、急速に拡大している光遺伝学の分野と動的プロセスの研究におけるその応用のニーズを満たします。

シグナル伝達ダイナミクスを含む生物学的プロセスの動的な調節の重要性は、ここ数年でますます認識されてきています18。上皮集合体で観察される ERK 活性の拍動的な動態は、最も顕著な例の 1 つです 16、17、19、20、21、22。ここで、一定の振幅と持続時間のERKパルスの周波数が、細胞死、生存、増殖、遊走などのさまざまな運命の決定を制御することが示されています16、19、21、22。蛍光バイオセンサーにより、これらのシグナル伝達イベントを適切な空間的および時間的スケールで視覚化できるようになりました。光遺伝学により、非侵襲的な方法で生物学的に関連する時間および空間スケールでこれらの生物学的プロセスを制御することも可能になります。我々は以前、周波数変調されたoptoFGFRまたはoptoRaf入力を適用すると、集団内のすべての細胞が同期的に応答する周波数変調されたERKダイナミクスレジームを引き起こすことができることを示しました16。これは、不均一で非同期のシグナル伝達挙動を引き起こすことが多い成長因子の一般的に使用される持続的大量適用とは対照的です16、19、23。ここで、LITOS は、特定の光媒介の optoFGFR 入力が適用されたときにこれが発生することを再度明らかにしました。 LITOSによる1つの光媒介光FGFR入力の適用により、集団均一な急峻なERK活性化とその後の適応が引き起こされ、集団のすべての細胞が同一のERKパルスを経験するようになりました（図4c）。低周波数で適用される複数の光パルスは、集団同期離散ERKパルスを引き起こす可能性があります（図5d）。対照的に、これらの光パルスが高周波で印加されると、optoFGFRの不活性化が可能ではなく5、持続的なERK活性が誘発される可能性がありました（図5d）。私たちは、LITOS および同様のデバイスのこれらの機能により、ウェスタンブロット、トランスクリプトミクス、または (リン) プロテオミクスなどの生化学的集団平均測定の信頼性が高まると考えています。ここで、集団同期ERKダイナミクスを誘導する能力により、生化学的アプローチを使用した信頼性の高い集団平均測定が提供されます。これは、不均一なシグナル伝達状態を平均化する可能性があるバルク成長因子刺激実験とは対照的です。例えば、一過性のオプトFGFR入力によって誘発されたERKパルスの高度に時間分解能なリンプロテオームは、生物学的に適切なタイムスケールでリン酸化部位の変動をマッピングし、受容体チロシンキナーゼ-MAPKシグナル伝達のより良い理解を提供する可能性があると我々は構想している。あるいは、オミクスアプローチ（トランスクリプトミクス、（ホスホ）プロテオミクスなど）と組み合わせることで、特定の運命決定（生存、増殖、分化など）を誘導できる望ましい合成ERK動態を呼び起こす能力があれば、ERK動態がどのように変化するかについて新たな洞察が得られる可能性がある。運命の決定に解読されます。光遺伝学的アクチュエーターとバイオセンサーの拡大し続けるレパートリーを利用することで、同様の実験ロジックを他の信号伝達システムに適用できると考えています。

LITOS のもう 1 つの重要な可能性は、光遺伝学的刺激のために長時間にわたって専用の顕微鏡を必要とする、数日間にわたる時間スケールで発生する生物学的プロセスの研究にあります。これは、2 週間にわたって展開される発生プロセスである 3D 乳房腺房形成における ERK シグナル伝達を光遺伝学的に制御するために LITOS を使用した別の研究によって示されています 24。私たちは、約1週間かかるプロセスで、外側細胞の生存と内側細胞塊のアポトーシスを通じて腺房内腔が形成される、ERK依存性の発生エピソードに焦点を当てました。我々は、ERKパルス周波数が内側細胞よりも外側細胞の方が高いことを発見し、したがってERKパルス周波数が生存対アポトーシスの運命を決定するという仮説を立てた。 optoFGFRおよびoptoRafアクチュエータを使用して、LITOSを使用して、さまざまな合成周波数変調ERKパルス領域を引き起こしました。われわれは、高周波ERKパルス療法が内部細胞の生存表現型を回復させ、腺房内腔の形成を妨げることを観察した。これらの結果は、組織培養インキュベーター内で行われる実験において、複数日に渡って発生する形態形成イベントを LITOS がどのように制御できるかを示しています。私たちは、LITOS を介した光遺伝学アクチュエーターの制御が、オルガノイド培養を含む 3D 生物学の幅広い用途に使用できると考えています。

LITOS はシンプルなデザインで多用途に使え、手頃な価格も魅力です。研究対象を CRY2 ベースのシステムに限定しましたが、LITOS の RGB LED マトリックスは、クリプトクローム、ドロンパ、および LOV (iLID、TULIP など) ドメインに基づく光遺伝学的アクチュエーターの制御も可能にするはずです 25。ただし、LITOS のシンプルさにはいくつかの制限がある場合もあります。最大電力密度は、他のオープンソースおよび商用デバイスと比較して範囲の下限にあります（補足表S1）。新規ユーザーには、LITOS が生成する光強度によってお気に入りの光遺伝学システムが活性化されるかどうかをテストすることをお勧めします。さらに、LITOS は、赤外光を必要とするフィトクロムベースのアクチュエーターとスペクトル的に互換性がありません。しかし、我々は、追加の波長で活性化できる新しい光遺伝学アクチュエータが将来利用可能になり 26、LITOS の応用範囲が拡大すると予想しています。

要約すると、私たちはオプトジェネティクス用の安価で堅牢で使いやすい LED 照明デバイスである LITOS を開発し、テストしました。 LITOS が MAPK シグナル伝達の研究にどのように使用できるかを説明しました。私たちは、信号分野以外の LITOS の幅広い用途を想定しています。たとえば、細菌における光制御遺伝子発現の研究 27、ショウジョウバエの発生生物学研究 28、または CRISPR-Cas9 光活性化可能なゲノム編集 29 に応用できる可能性があります。

LITOS、注文方法、およびそのオープンソースコードに関する詳細情報は、次の GitHub リポジトリ (https://github.com/pertzlab/LITOS) で入手できます。

LITOS は、細胞刺激用に市販の RGB LED マトリックス (Shenzhen Xuyang Technology Co. Ltd. の FM6126A IC を搭載した P3 屋内 LED ディスプレイモジュール、32 × 64 ピクセル、他の IC を搭載したモジュールも使用できる可能性があります) で構成されています。そしてカスタムのプリント基板 (PCB) です。 RGB マトリックスの LED のピーク発光は、赤色が 620 ～ 630 nm、緑色が 520 ～ 525 nm、青色が 465 ～ 470 nm です。各 LED について、青色 LED の最大電力密度 135 ± 0.11 µW/cm2 で 256 の強度レベルを設定できます。 PCB は ESP32-WROOM モジュール (Espressif Systems Shanghai Co. ltd.) を中心に構築され、LED マトリクスの制御ユニットとして機能します。このタスクに必要な回路に加えて、1.5 インチ OLED スクリーンモジュール (SSD1351 制御 IC 付き) とブザー (AI-1223-TWT-3 V-2-R、PUI オーディオ) により、追加のオーディオビジュアル出力の可能性が提供されます。ユーザー入力にはコントロールボタン (B3F-4050、オムロン) が使用されます。追加されたUSBシリアルUARTブリッジ(231-XS、FTDI)により初期プログラミングが可能です。電力は、PCB 上に配置された 2.1 mm × 5.5 mm バレルジャックコネクタに接続された外部 5 V 壁面電源アダプタによって供給されます。 3.3 V という低い電圧を必要とするコンポーネントがあるため、リニア電圧レギュレータ (LM1117、Texas Instruments) が PCB に追加されました。 LITOS の回路図、PCB レイアウトファイル (KiCad 6.01、https://www.kicad.org/) およびその部品表は、GitHub リポジトリ (https://github.com/pertzlab/LITOS) にあります。。

PCB は、必要な電力を供給するケーブルと信号伝送に使用される 16 ピンフラットリボンケーブルを使用して RGB LED マトリックスに接続されます。どちらのケーブルも、既存のヘッダーを介して PCB と RGB LED マトリックスに接続します。最後に、PCB は外部 5 V 電源に接続されます。さらに、PCB は USB ケーブルを介してコンピュータに接続できます。これは、LITOS ソフトウェアを ESP32 マイクロコントローラーに最初にロードするために必要です (PCB メーカーによってロードされていない場合)。その後、Wi-Fi 経由でコンピュータとの接続が確立されます。

照明野を測定するために、凡例に指定されているように、印画紙 (Ilford Multigrade RC DeLuxe 44 M パール) を、LITOS によって生成されたさまざまな強度の青色光に 1 秒露光しました。同一の露出を使用して、LED マトリクスからさまざまな距離に印画紙を 0.17 mm スライドガラス上に配置しました。印画紙を青色光で露光した後、1分間現像しました。照明フィールドの写真は、解像度 400 dpi のグレースケールでスキャンされました。照明フィールドの強度プロファイルは、ImageJ 1.53 を使用して作成されました。

PCB 上にある ESP32 は、Arduino ハードウェア抽象化レイヤーを使用して C/C++ でプログラムされています。構成インターフェイスは、単一ページアプリケーションとして構成インターフェイスを構築するための進歩的な Web フレームワークである Vue でプログラムされています (https://vuejs.org/)。ソースコードは、GitHub リポジトリ (https://github.com/pertzlab/LITOS) にあります。

マウス胎児線維芽細胞株 NIH3T3 は、カリフォルニア州ラホーヤのソーク生物学研究所の T. Hunter から寄贈されました。非腫瘍原性ヒト乳房上皮細胞株 MCF10A は、マサチューセッツ州ボストンのハーバード大学医学部の JS Brugge から寄贈されました。 NIH3T3 細胞を、10% ウシ胎児血清 (FBS)、200 U/ml ペニシリン、200 μg/ml ストレプトマイシン、および 200 nM l を添加した Sigma-Aldrich のダルベッコ改変イーグル培地 - 高グルコース培地 (DMEM) (参照: D5671) で維持しました。 -グルタミン。 NIH3T3 細胞の挙動の変化を避けるために、継代前にコンフルエントを 40 ～ 50% 未満に維持しました。 MCF10A 細胞は、5% 馬血清、200 U/ml ペニシリンおよび 200 μg/ml ストレプトマイシン、20 ng/ml EGF (Peprotech)、10 μg/ml インスリン ( Sigma-Aldrich/Merck）および 0.5 μg/ml のヒドロコルチゾン（Sigma-Aldrich/Merck）。

NIH3T3 細胞と MCF10A 細胞は、NIH3T3 細胞の場合、200 U/ml ペニシリン、200 μg/ml ストレプトマイシン、200 nM L-グルタミン、0.5% ウシ血清アルブミンを含む Ham's F-12 Nutrient Mixture (Sigma N4888) からなる培地中で飢餓状態にしました。 DMEM: MCF10A 細胞の場合、0.3% BSA、0.5 μg/ml ヒドロコルチゾン、200 U/ml ペニシリンおよび 200 μg/ml ストレプトマイシンを添加した F12 (Sigma D8437)。 NIH3T3 細胞と MCF10A 細胞は、optoFGFR (mCitrine 蛍光タンパク質と融合) または optoRAF (同様に mCitrine 蛍光タンパク質と融合) を発現するように安定的に改変されました。 OptoFGFR はレンチウイルスベクター (Lyn-cytoFGFR1-PHR-mCit) によって形質導入され、optoRAF は PiggyBac プラスミド (pPB3.0.PURO.CRY2.cRAF.mCitrine.P2A.CIBN.KrasCT) によって形質導入されました。どちらのシステムも、安定に形質導入された細胞を選択するために使用したピューロマイシン耐性を発現します。これらの光遺伝学的アクチュエーターを発現する細胞株にさらに 2 つの追加の PiggyBac プラスミドをトランスフェクトし、ハイグロマイシン耐性を持つ ERK-KTR-mRuby2 とブラストサイジン耐性を持つ核マーカー H2B-miRFP703 を安定して発現させました。 NIH3T3 細胞の場合、jetPEI トランスフェクション試薬を使用して PiggyBac プラスミドをトランスフェクトしました。 MCF10A 細胞の場合、プラスミドを FuGENE HD Transfection Reagent (Sigma) でトランスフェクトしました。トランスフェクション後、細胞は抗生物質で選択されました。さらに、バイオセンサーの発現の均一性を高めるために、MCF10A 細胞をクローン増殖させながら、NIH3T3 を FACS ソートしました。

イメージング実験のために96ウェルプレートに2 * 103 NIH3T3細胞/ウェルを播種し、ウェスタンブロッティングのために6ウェルプレートに1.5 * 106 MCF10A細胞/ウェルを播種しました。どちらの場合も、播種前に 10 μg/mL フィブロネクチンでコーティングされた光学ガラス底マルチウェルプレートを 1 時間使用しました。実験開始前に細胞を 24 時間飢餓状態にしました。

すべての実験において、LITOS 照明パターンは LibreOffice Calc で作成されました。 CSV ファイルをアップロードするには、ラップトップを LITOS のアクセスポイントに接続し、ユーザーインターフェイスを使用しました。次に、マルチウェルプレートをインキュベーター内の LED マトリックス上に置きました。ウェルプレートを適切に配置するために、CNCフライス盤専用のプレキシガラスマスクを使用しました（補足図S3c）。光遺伝学的実験を開始する前に、細胞をインキュベーターの条件に少なくとも 1 時間適応させました。実験プロトコールで許可されている場合は、実験中にインキュベーターを開けることは避けました。刺激後、ウェル内に存在する培地に同量の 4% パラホルムアルデヒド溶液を加えることにより細胞を固定しました。示されているすべての実験について、さまざまな実験点が特定の時点で刺激され、実験の終了時に同時に固定されました。 10分間の固定後、細胞をPBSで2回洗浄しました。

広視野蛍光顕微鏡画像は、20× Plan Apo Lambda (NA 0.75) および Andor Zyla 4.2+ カメラを備えた Nikon Eclipse Ti 顕微鏡を使用して取得しました。励起には、次の LED 光源を使用しました:ERK-KTR の場合は 555 nm、核マーカーの場合は 640 nm)。 optoFGFR の刺激には、488 nm LED 光源を使用しました。画像解析は私たちの研究室に確立されたパイプラインを使用して行われました16。まず、Ilastik ソフトウェア (バージョン 1.3.3) を使用して、H2B 核マーカーを入力画像として使用して核の確率マップを作成しました。 Ilastik は、フィルターバンクを使用してピクセル特徴を抽出し、ランダムフォレストアルゴリズムを使用してそれらを分類します。次に、CellProfiler（バージョン3.0.0）でインスタンスセグメンテーションを実行し、核から2ピクセル離れた位置から開始して最大幅5ピクセルのリング形状にサイトゾルをセグメント化しました（図4b）。核とサイトゾルのセグメンテーション間の距離が 2 ピクセルであるため、核のセグメンテーションの不正確さが結果に影響を与えません。これら 2 つのセグメンテーションマスクを使用して ERK-KTR シグナルを測定した後、サイトゾルと核に存在する ERK-KTR の比 (C/N 比) を計算しました。 KTR 構築物の細胞質対核の相対蛍光 (C/N 比) は ERK 活性と相関しており、単一細胞におけるキナーゼ活性の代用として使用できます。

ウェスタンブロッティングでは、細胞を最初に 4% パラホルムアルデヒドで 10 分間固定し、次に 2% SDS 緩衝液 (TrisHCl pH 6.8 溶液) で溶解しました。タンパク質濃度は、Pierce BCA タンパク質アッセイキット (Ref. 23227、Thermo Scientific) を使用して測定しました。各細胞溶解物から 10 μg のタンパク質を SDS-Page (10% 自作ゲル) にロードし、PVDF ウェスタンブロット膜 (Ref: 3010040001、Roche) にブロットしました。メンブレンを、Cell Signaling の総 ERK に対するウサギモノクローナル抗体 (参照: #4695) またはリン酸化 ERK に対するウサギモノクローナル抗体 (参照: #4370) とインキュベートし、その後、Amersham ECL ウサギ IgG、HRP 結合全抗体 (ロバ由来、NA934VS) を二次抗体として使用します。次に、GE Healthcare の Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagents (RPN2232) を使用してメンブレンを現像しました。

単一セルのデータは、相対図の凡例で説明されているように、箱ひげ図または平均と平均の標準誤差で表されます。データ分析と図は R (バージョン 3.6.3、https://www.r-project.org/) で作成されました30。データ分析と画像作成に使用される対応するデータと R ノートブックファイルは補足資料にあります。

分析に使用された R ノートブックを含むすべてのデータセットは補足情報に含まれています。

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この研究は、スイス国立科学財団助成金 Div3 310030_185376 によって Olivier Pertz (Schweizerischer Nationalfonds zur Förderung der Wissenschaftlichen Forschung) に支援されました。私たちは、ベルン大学の化学、生化学、薬学部門、顕微鏡画像センター (https://www.mic.unibe.ch) の技術ワークショップ、およびベルン芸術アカデミーの Tim Oliver Rod に感謝します。技術サポートについては (https://www.hkb.bfh.ch/en/) を参照してください。

これらの著者、トーマスクリストフヘーナーとアレックスエーリッヒランドルトも同様に貢献しました。

ベルン大学細胞生物学研究所、3012、ベルン、スイス

トーマス・クリストフ・ヘーナー、アレックス・エーリッヒ・ランドルト、コラリー・デソージュ、ルシアン・ヒンダーリング、パオロ・アルマンド・ガリアルディ、オリヴィエ・ペルツ

生命システム科学工学部、チューリッヒ工科大学、4058、バーゼル、スイス

アレックス・エーリッヒ・ランドルト

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TH は光遺伝学プレートの設計を考案しました。 AL はハードウェアとソフトウェアの開発を行いました。 CD は、optoFGFR、optoRaf、ERK-KTR からなる遺伝回路を構築しました。 PAG は、optoFGFR、optoRaf、および ERK-KTR を備えた MCF10A 細胞株を生成しました。 TH は細胞ベースの実験を実施し、分析しました。 TH、PAG、LH は照明野測定を実行しました。 TH はすべての図を作成しました。 LH は 3D プリントされたケースを作成しました。 OPは作品を監修しました。 TH、PAG、OP が論文を執筆しました。著者全員が原稿をレビューしました。

オリヴィエ・ペルツへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガーネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

補足ビデオ1.

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転載と許可

Höhener、TC、Landolt、AE、Dessauges、C. 他 LITOS: 光遺伝学的刺激のための多用途 LED 照明ツール。 Sci Rep 12、13139 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-17312-x

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受信日: 2022 年 3 月 1 日

受理日: 2022 年 7 月 25 日

公開日: 2022 年 7 月 30 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-17312-x

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